Dowody na transmisję wirusa Camel-to-Human z koronawirusa MERS AD 3

Wyeluowany RNA przeszukiwano pod kątem regionu MERS-CoV w górę od genu E (regionu w górę) i potwierdzano przez celowanie w otwartym obszarze odczytu ramki ORFla i ORF1b przy użyciu RT-PCR w czasie rzeczywistym, jak opisano wcześniej. Dalsze potwierdzenie było wykonywane przez częściowe sekwencjonowanie zależnej od RNA polimerazy RNA (RdRp) i regionów nukleokapsydu (N) genomu wirusa, zgodnie z zaleceniami Światowej Organizacji Zdrowia.5 Oba testy przeprowadzono na oryginalnych próbkach pobranych od pacjenta i od Camel B. (Szczegóły dotyczące testu RT-PCR i sekwencjonowania znajdują się w Dodatku Uzupełniającym.) Sekwencjonowanie wirusowych genomów
Wirusowy RNA wyekstrahowany z supernatantów hodowli, które zostały zaszczepione próbkami od pacjenta i od Camel B poddano amplifikacji RT-PCR za pomocą termocyklera ABI Veriti (Applied Biosystems) z użyciem par primerów obejmujących całą długość genomu wirusowego . Fragmenty RT-PCR następnie zsekwencjonowano, jak opisano w dodatkowym dodatku. Sekwencje zdeponowano w GenBank i podano numery dostępu (KF958702 MERS-CoV-Jeddah-human-1 dla izolatu pacjenta i KF917527 MERS-CoV-Jeddah-camel-1 dla izolatu wielbłąda). Regiony genomowe zawierające unikalne mutacje również częściowo resekwencjonowano z oryginalnych próbek pobranych od pacjenta i wielbłąda.
Analiza filogenetyczna
Sekwencje dopasowano do wszystkich referencyjnych szczepów MERS-CoV pobranych z GenBank. Analizę filogenetyczną i obliczenia odległości przeprowadzono za pomocą oprogramowania Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA), wersja 5, za pomocą metody łączenia sąsiadów z 1000 powtórzeń bootstrap.
Konwencjonalny test immunofluorescencyjny
Próbki surowicy zebrane od pacjenta i wielbłądów seryjnie rozcieńczono do 1: 51 200. Tradycyjny test immunofluorescencyjny wykrywający przeciwciała anty-MERS-CoV przeprowadzono w komórkach Vero zainfekowanych MERS-CoV, przy użyciu dostępnego na rynku zestawu testowego (Anti-MERS-CoV IFT, EUROIMMUN), jak opisano wcześniej.
Wyniki
Wymazy z nosa, które pobrano od pacjenta w dniach 1, 4, 14 i 16 w szpitalu, wszystkie były dodatnie dla regionów MUT-CoV upE, ORF1a i ORF1b w czasie rzeczywistym RT-PCR (Tabela 1). Pierwsza próbka donosowa pobrana z jednego wielbłąda (Camel B) była również pozytywna dla trzech regionów (Tabela 1). Druga próbka pobrana z tego wielbłąda 28 dni później była ujemna. Próbki nosa zebrane z innych wielbłądów dnia (siedem wielbłądów) i 28 dnia (osiem wielbłądów) były ujemne dla RNA MERS-CoV (tabela 1). Próbki mleka, moczu i odbytu pobrane ze wszystkich wielbłądów były ujemne dla RNA MERS-CoV
[więcej w: Fordanserki, ginekologia estetyczna, operacja endometriozy ]

Powiązane tematy z artykułem: Fordanserki ginekologia estetyczna operacja endometriozy